檢測(cè)技術(shù)服務(wù):體內(nèi)磷酸化位點(diǎn)鑒定--檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情

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體內(nèi)磷酸化的過程就是在激酶的催化作用下，將三磷酸腺苷（ATP）的磷酸根基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白的氨基酸側(cè)鏈上，ATP隨之變?yōu)槎姿嵯佘眨ˋDP）。磷酸化修飾可以發(fā)生在多種氨基酸殘基上，主要集中在肽鏈中的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基上，這些殘基上具有游離的羥基，且本身不帶電荷，當(dāng)磷酸化作用后，蛋白質(zhì)便具有了電荷，從而使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起蛋白質(zhì)活性的變化。

體內(nèi)磷酸化位點(diǎn)鑒定主要通過質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)分析，即通過特定的步驟（如抗體富集、金屬富集和凝集素富集等）獲得富集的修飾肽段，進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。在一次質(zhì)譜鑒定中可以可靠地鑒定數(shù)千種被修飾的多肽。對(duì)體內(nèi)磷酸化位點(diǎn)的定位識(shí)別仍然較為武斷，對(duì)于某些修飾位點(diǎn)的鑒定可能并不可靠。質(zhì)譜檢測(cè)所得出的實(shí)際質(zhì)譜圖在處理過程中需要考慮的因素更為復(fù)雜，如質(zhì)譜中的噪音信號(hào)、磷酸化修飾中未修飾片段的中性丟失以及具有相同質(zhì)荷比的修飾后的氨基酸與非修飾氨基酸的區(qū)別等。

在處理磷酸化蛋白質(zhì)樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí)，有必要對(duì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行假陽(yáng)性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）的控制。對(duì)于肽段磷酸位點(diǎn)鑒定來(lái)說，可使用質(zhì)量可靠性算法評(píng)估磷酸化位點(diǎn)可信度，這種算法主要包括基于概率對(duì)鑒定質(zhì)量打分（如建立數(shù)據(jù)模型）和基于假陽(yáng)性率（如Target-Decoy算法）進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于蛋白磷酸化修飾而言，錯(cuò)誤定位率（false localization rate，F(xiàn)LR）沒有較好的實(shí)現(xiàn)方法，通常是通過合成肽段來(lái)評(píng)估，或者是針對(duì)僅包含一個(gè)修飾位點(diǎn)的肽段才有較好的效果。目前，可通過位點(diǎn)定位軟件試圖評(píng)估某個(gè)給定峰匹配到特定位點(diǎn)的概率，如A-Score算法等；或通過計(jì)算兩個(gè)修飾位點(diǎn)間的搜索引擎給的打分差值進(jìn)行評(píng)估。在選擇這些算法的過程中，要綜合考慮質(zhì)譜平臺(tái)檢測(cè)的類型、搜庫(kù)算法與軟件的便捷性，從而為后續(xù)的分析提供較為可靠的磷酸化位點(diǎn)。

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